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辉瑞的新冠口服药物将新冠患者住院或死亡风险降低了89%
辉瑞的新冠口服药物PAXLOVID（核心成分为PF-）展现了惊人疗效，今天给大家分享下其研发历程。PF-的研发故事得追溯到辉瑞在SARS期间发现的PF-。当时辉瑞已经研发出PF-，但随着SARS在年的结束，临床研发终止了。
偶然？7年前的沉寂分子焕发新生
Rupintrivir是人鼻病毒（HRV）3C蛋白酶抑制剂（年发现），随后有科学家解出了TGEV（冠状病毒的一种）Mpro与rupintrivir的共晶结构。TGEV的晶体结构曾被用来同源建模SARS的3CL蛋白酶结构，当时有科学家认为rupintrivir有可能会是设计SARS的3CL蛋白酶抑制剂的先导化合物。然而，辉瑞的研究人员发现rupintrivir对SARS的3CL蛋白酶活性很弱。以rupintrivir为起点，在保留Michaelacceptor的基础上，研究人员随后优化得到活性还可以的SARS-mol2分子（本质是替换了合适的氨基酸侧链）。最后，对SARS-mol2经过一系列的SAR优化得到共价抑制剂PF-（见图2或图3的化合物）。年新冠爆发时，辉瑞发现SARS和SARS-CoV-2病毒的3CL蛋白酶在与底物结合的催化域中的序列00%相同，因此重新捡起了这个7年前的分子继续研发。
图.Rupintrivir与SARS-mol2的分子结构。
图2.SARS-CoV-2-3CL蛋白酶与PF-（和Cys45共价结合）的共晶结构（PDB：6XHM）。From:JMC
分子优化得到PF-
如图3所示，PF-（即图3的化合物）的活性非常好且代谢稳定，但渗透性和口服利用度都很低，导致很难口服给药。为了改善的渗透性和口服利用度，研究人员将的α-羟甲基酮（因为较多氢键给体通常与口服生物利用度低有关）改为氰基得到化合物2。2的口服利用度F（.4vs.7.6）和从胃肠道吸收的口服剂量分数FaxFg(3.3vs.38)都显著提高，但活性明显降低。随后，研究人员同时引入氮杂双环（模拟环状Leu）和苯并噻唑，得到化合物3。如图3所示，3的渗透性提升显著（Papp：0.vs.0.3），但3的氮杂双环片段占据了疏水口袋，使其无法与Gln89形成氢键（如图4C所示），导致其活性远不如。研究人员观察到3的吲哚片段并没有很好的占据口袋，为此他们将吲哚改为甲基磺酰胺，得到的化合物4与Gln89和Glu66都形成氢键，且各方面指标提升明显（EC50=nM；F=0%；FaxFg=84）。
基于甲基磺酰胺的相互作用模式，研究者进一步优化得到含三氟乙酰胺的化合物5。5和4的Ki接近，但5的渗透性和EC50比4好0倍（Papp：3.vs..56；EC50：85.3nMvs.nM），且5在老鼠和猴模型上的药代动力学表现同样优异（F分别为33%和7.9%；FaxFg分别为00%和66%）。最后，将5的苯并噻唑改为氰基即得到了临床分子PF-（即化合物6），6的活性和生物利用度进一步提升，且通过与SARS-CoV-2-3CL蛋白酶的孵育实验发现6是可逆共价抑制剂。由于6具有便于放大合成、更好的溶解性（便于简单制剂研究毒理学）和降低差向异构化等优点，研究人员选择6进入临床。
图3.SARS-CoV-2-3CL蛋白酶抑制剂的体外和体内参数。从左到右分别为3CL蛋白酶活性Ki、抗病毒活性EC50、通透性Papp、内在清除率CLint、血浆清除率CLp、口服生物利用度F和从胃肠道吸收的口服剂量的分数(FaxFg)。
图4.（A）SARS-CoV-2-3CL蛋白酶与化合物的共晶结构。（B）化合物3的二甲基-双环[3..0]脯氨酸模型（蓝色）与亮氨酸残基（青色）的构象叠加。（C）化合物3有效地填充了由Met49、Met65和His4形成的亲脂性口袋，但不能与Gln89形成有效的氢键。（D）化合物4与Gln89和Glu66都形成氢键。（E）临床候选PF-（化合物6）与SARS-CoV-2-3CL蛋白酶结合的共晶结构。(F)Cys45与化合物6的可逆共价结合。
改善代谢得到临床药物PAXLOVID
探究PF-的代谢时，研究人员发现加入CYP3A4/5抑制剂时，PF-在人肝微粒体的内在消除率（CLint）会显著下降（24.5vs.4.33）；而且，CYP3A4会对PF-的多个位点（如叔丁基、氮杂双环和吡咯烷酮）进行氧化代谢。这些结果表明CYP3A4对PF-的代谢至关重要。为此，研究人员想通过与强效CYP3A4抑制剂利托那韦（RTV）共同给药来提高临床中PF-治疗浓度。利托那韦常用作蛋白酶抑制剂（如地瑞纳韦、洛匹那韦等）的药代动力学增强剂，这些蛋白酶抑制剂也是通过CYP3A4进行代谢清除。
图5C显示了单独服用50mgPF-和mgPF-+利托那韦获得的成人初步血浆浓度与时间的药代动力学曲线。PF-安全且耐受性良好，当与RTV共同给药时，口服血浆浓度显著增加且远高于SARS-CoV-2抗病毒的EC90值。
图5.PF-的临床前毒理学和健康成人参与者单次上升剂量暴露研究。（A）每天一次给予PF-的大鼠口服毒代动力学暴露（第4天）。（B）每天两次给予PF-的猴子口服毒代动力学暴露（第5天）。（C）成人口服50mgPF-和mgPF-+利托那韦RTV的血浆浓度。（D）成人口服mgPF-和00mg利托那韦（t=-2、0、2小时）2小时内的血浆浓度。
小结
PF-的发现始于辉瑞在SARS期间的工作，虽然有偶然性，但充分展现了公司深厚的科研底蕴。辉瑞的科学家以拟肽rupintrivir为起点，通过替换类氨基酸残基侧链得到先导化合物SARS-mol2分子。随后经过经典的SAR得到了活性很好的PF-，再基于改善口服利用度的需求优化得到PF-。最后通过药代研究发现加入利托那韦能改善代谢消除率，得到临床药物PAXLOVID。
参考文献：
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2.RobertL.Hoffman,etal."DiscoveryofKetone-BasedCovalentInhibitorsofCoronavirus3CLProteasesforthePotentialTherapeuticTreatmentofCOVID-9".J.Med.Chem.,63,2,–
3.DAFYDDR.OWEN,etal."AnoralSARS-CoV-2MproinhibitorclinicalcandidateforthetreatmentofCOVID-9".Science2Nov
DOI:0.26/science.abl
